基因编码的Ca2+指示剂（GECIs）被广泛用于监测神经活动。随着GECIs的发展，Ca2+传感器的响应动力学、灵敏度和亮度都得到了进一步优化，其中GCaMP最为突出。理想情况下，GECIs在神经元群中均匀表达，具有足够的敏感性和适宜的荧光范围，可用于体内应用。
目前常用的策略是利用病毒载体将GECIs递送到神经元，然而病毒载体的脑内注射（IC）往往会根据病毒颗粒浓度介导不同强度表达，造成GCaMP胞内局部聚集，从而影响细胞功能以及造成细胞死亡；系统注射时，每个细胞所感染的病毒颗粒数量较低。此外，广泛使用的GECIs(如GCamp6f)亮度不够，无法与系统给药兼容实现双光子成像。
2023年2月4日挪威Oslo大学生物科学系S. Grødem和 I. Nymoen团队在期刊Nature Communications 上发表了《An updated suite of viral vectors for in vivo calcium imaging using intracerebral and retro-orbital injections in male mice》一文，揭示了PHP.eB血清型包装的jGCaMP8及胞体靶向EE-RR-jGCaMP8可用于系统性给药实现体内Ca2+成像。另外，团队还构建了胞质定位的RiboL1-jGCaMP8，其脑内注射表现出前了所未有的标记密度和信噪比，无神经纤维网的污染。
01 不同性能GECIs的比较
在合理的激光功率（输出功率为40-50 mW）下，当选用PHP.eB血清型及IC注射方式时，GCaMP不同变体均可检测到Ca2+变化的荧光信号。选择系统性给药时，大多数GECI体内检测Ca2+亮度较低不足以进行成像。最近开发的GECI jGCaMP7s，jGCaMP8s和jGCaMP8m都足够明亮，可以与RO注射（眶后注射）搭配使用。
表1 GECI变体的初步筛选
图1 病毒RO注射后，GECI体内筛选
02 胞体定位的jGCaMP8
由于GCaMP快速动力学和更高灵敏度导致从树突等神经纤维中也会检测到信号，这既干扰胞体中Ca2+瞬变的定量，又引入噪声降低了可记录的细胞数量。因此作者首先构建了EE-RR和RPL10a标记的jGCaMP8，通过限制GECI的胞体定位来减轻这些影响。EE-RR胞体标记的jGCaMP8在RO或IC注射时可检测到强烈的钙离子信号，但IC注射也存在类似的神经纤维网信号。Ribo-jGCaMP8进行 RO注射时，均表达于体细胞中，但表达缓慢并出现荧光聚集现象，GCaMP亮度大大减弱，需要高激光强度用于体内成像；而IC注射需6周后，Ribo-jGCaMP8可显示出明亮和动态的信号，并可稳定表达到10周。
图2 通过RO和IC注射在初级视觉皮层中表达胞体定位jGCaMP8
03 RiboL1-GCaMP8的特性
为了提高表达率，作者选用三个不同的连接子序列取代了Ribo-GCaMP8的连接子区：一个更长、更灵活的序列以及两个刚性螺旋连接体的RiboL1-GCaMP8。更灵活、更长的连接子与EE-RR-GCaMP的氨基酸序列相同，可大大提高蛋白的表达率。RiboL1-GCaMP8病毒IC注射后两周可检测到大量单细胞中强烈的表达，而荧光信号在数周内无聚集（图2）。当选择RiboL1-GCaMP8进行RO注射方式时，RiboL1-jGCaMP8的亮度相对暗淡，类似于Ribo-jGCaMP8。
图3 在RO和IC注射后，胞体定位jGCaMP8表达的稳定性
jGCaMP8的高灵敏度和亮度可能导致神经纤维网信号，影响用于测量神经元活动的ΔF/F数值。进一步实验发现jGCaMP8s和EE-RR-jGCaMP8s与神经经纤维网信号高度相关，而RiboL1-jGCaMP8s的相关性较低。另外在RO和IC注射时，仅有RiboL1-jGCaMP8s 体细胞和神经枕信号亮度之间的比率最高，信号分布均匀，IC注射时识别细胞数量最高。而相对于IC注射，jGCaMP8s和EE-RR-jGCaMP8 RO注射产生了更高的体细胞和神经枕信号亮度之间的比率，细胞识别数目无差异但信号分布更均匀。因此与GECI结构相比，iRiboL1-jGCaMP8s选择IC注射方式时可更好地估计细胞体中Ca2+动力学的波动，无神经纤维网信号的干扰。
图4 不同注射方式时，GECI基线亮度、信噪比和细胞密度检测
04 GECI系统性注射的应用
作者进一步在PV-Cre小鼠中RO注射EE-RR-jGCaMP8，IC注射Cre依赖的hM4D受体（DREADD），结果发现EE-RR-jGCaMP8全脑表达，同时介导目的脑区PV神经元hM4D表达。因此RO注射适合使用转基因小鼠实现特定细胞类型全脑表达GECI，操纵特定细胞群的活性。另外在背侧膝状核中注射轴突定位的红色GECI （hSyn-Axon-jREX-GECO1），在V1(初级视觉皮层)中IC注射RiboL1-jGCaMP8。两周后V1的轴突和细胞体进行成像，发现来自两种GECIs的强信号，实现对胞体及轴突活性进行双色成像。
图5 轴突和体细胞活动的体内成像
结论
以上数据表明，jGCaMP8和EE-RR-jGCaMP8非常适合系统性递送，并在两周内产生全脑表达，数月内保持稳定，而RiboL1-jGCaMP8表现出前所未有的标记密度和信噪比，可用于脑内病毒注射。
总之，作者提出了一套可用于全身及脑内局部给药的GECI，可较长时间内显示出高性能和可持续性表达。方法简单，实验灵活性高，成本低。
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