病毒策略
野生PRV的分离株（Becker株）毒性较大，在神经环路传播过程中，既可以顺突触传播，又可以逆突触传播。而PRV的疫苗株（Bartha株）毒性较低，基于PRVBartha株构建的重组示踪工具病毒，能够严格逆向跨多突触标记神经网络。病毒感染神经细胞后，在胞内复制并表达目的基因，子代病毒运输到突触后，逆向跨突触进入上游神经元，开始新一轮的复制及逆向跨突触传播等过程。
图1. PRVBartha株逆向跨多突触标记
PRV-hUbC-EGFP注射嗅结节（TU）48小时后，逆向跨多突触标记上游脑区，包括M1，M2，Aco，Piri，OB，VTA等区域，表明这些脑区对TU有直接或间接的投射。
图2. 向脑区TU注射PRV，可标记该注射区域不同级数的输入神经网络
应用
1.研究大脑特定区域的全脑范围多级输入网络结构；（见案例展示一）
2.研究特定两个脑区在全脑的多级输入网络；（见案例展示三）
3.神经发育过程中的神经网络变化；
4.神经精神疾病模型中，大脑中枢及外周信息输出神经网络结构特征和异常变化；
5.神经损伤及康复模型中，大脑中枢及外周信息输出神经网络的连接状况的损伤程度和恢复程度；
6.追踪外周器官与中枢神经系统间的联系通路。（见案例展示二）
案列展示
实例一：DS的逆向跨多级病毒示踪
实验动物：C57BL/6Jmice
使用的病毒：PRV152-GFP
实验方法和结果：将PRV152-GFP注射到小鼠双侧背侧纹状体（DS），观察到PRV152-GFP逆行跨多级到了R-NG、DMV、NTS、AP、PBNdl和PBNm，根据先前的结果进一步验证了R-NG→PBNdl→SNc通路的存在。
图3. R-NG→PBNdl→SNc通路的验证（HanW,et al.,Cell,2018）
实例二：膀胱壁神经的逆向跨多级病毒示踪
实验动物：C57BL/6Jmice
使用的病毒：PRV-EGFP、PRV-RFP
实验方法和结果：将PRV-EGFP注射到小鼠膀胱壁后，在皮层S1/M1L5锥体神经元观察到EGFP信号。分别将PRV-EGFP与PRV-RFP注射到小鼠右侧和左侧膀胱壁，在皮层S1/M1L5锥体神经元观察到EGFP和RFP共同表达。表明PRV-EGFP、PRV-RFP无差别逆行跨多级到皮层S1/M1L5锥体神经元，皮层S1/M1L5锥体神经元为支配膀胱壁的上游脑神经元群。
图4. 膀胱上游皮层M1L5锥体神经元群的鉴定（YaoJ,et al.,NatNeurosc,2018）
实例三：研究特定两个脑区在全脑的多级输入网络
实验动物：C57BL/6小鼠
使用的病毒：RV152(GFP)、PRV614(RFP)
实验方法和结果：在C57BL/6小鼠两侧嗅球分别注射PRV152(GFP)及PRV614(RFP)，同时控制感染时程，检测荧光蛋白在全脑的表达分布。在蓝斑核脑区观察到若干被两种颜色病毒共同标记的神经元，表明这些脑区的神经元同时参与调控两侧嗅球的信息处理。同理，通过该方法，还可解析出大脑某两个核团的共同的一级甚至多级上游，即大脑那些核团那类神经元在同时控制其他两个脑区的功能。
图5. 不同脑区中荧光蛋白的表达分布
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