时间：2021-07-28 14:54
肝炎（Hepatitis）是肝脏的炎症，其造成原因不同，常见的是病毒导致的，此外还有自身免疫造成的，酗酒也可以导致肝炎。由病毒造成的肝炎按照其病毒系列不同分为六种类型，其中乙型肝炎由乙型肝炎病毒（HBV）感染导致。虽有疫苗和治疗方法，但目前乙型肝炎仍不能完全治愈。
感染HBV，病毒进入肝细胞后，病毒衣壳释放它的基因组，一个松弛的环状DNA （rcDNA）进入肝细胞的细胞核。然后将rcDNA转化为共价闭合的环状DNA（cccDNA），作为病毒RNA转录的模板。这一过程是抗病毒治疗的主要障碍。
图1. HBV生活周期（PMID: 30282709）
今年7月Journal of Hepatology（IF：25.083）上刊登的文章《Novel function of SART1 in HNF4α transcriptional regulation contributes to its antiviral role during HBV infection》中，作者通过使用各种HBV模型，描绘了SART1通过调控部分干扰素刺激基因（ISGs）的表达来发挥其抗HBV活性，为抗HBV研究打开了一扇窗。
图2. 登刊信息
既往研究表明，SART1通过对ISGs的调控来抑制丙型肝炎病毒（HCV）的感染，故作者推测SART1对HBV感染也可能具有相同的作用。
因此，在这篇文章中，作者先检查了SART1对HBV复制的作用。作者通过慢病毒建立SART1干扰和过表达的HepG2-NTCP细胞，观察其HBV表达水平。结果显示，过表达SART1显著抑制了HBV复制标记物表达，包括HBeAg、HBsAg、HBV DNA以及细胞内HBc和pgRNA，但cccDNA未受影响（见图3）。反之，下调SART1水平后，上述各指标水平均明显升高，cccDNA同样未受影响。
图3. SART1对HBV感染的影响
那么，SART1基因是如何在肝细胞中抑制HBV复制的呢？于是，接下来作者研究了其中的分子机制。
既往研究提示，SART1通过直接转录调控一些ISGs和选择性剪接IEGs来发挥其抗HCV活性。因此作者观察了HepG2-NTCP细胞中SART1表达对ISGs和IEGs水平的影响。siRNAs 介导的SART1敲低显著降低了某些经典ISGs（包括MX1和ISG15）的表达，SART1敲除也可以降低IEGs的表达（见图4）。
图4. SART1干扰/敲除对ISGs水平的影响
为了研究SART1是否通过HCV相同的途径影响HBV感染，作者使用络氨酸激酶（JAK）抑制剂（竞争性地结合到JAK1/3激酶的催化区域）以阻断下游ISGs的表达。结果提示，JAK抑制剂阻断了ISGs的表达，但对SART1表达没有影响，同时仍能增加HBV复制标记物HBeAg、HBsAg、HBV DNA、HBV pgRNA和HBV核心蛋白的水平（见图5）。干扰素（IFN）α和β受体亚基2（IFNAR2）敲除的实验也验证了这一结果。
这些结果证明了，SART1可以独立于其对ISGs表达的调控来调控HBV复制。
图5. SART1抑制HBV复制不依赖于IFN途径
既然，SART1可以独立于IFN的方式抑制HBV复制。那么是什么途径对其有调节作用呢？
为了剖析SART1发挥其抗HBV作用的机制，作者首先评估了其对不同HBV启动子的作用。相对表达水平验证显示，敲除SART1 显著增强了HBV核心启动子和X启动子的活性，但不影响pre-S1或pre-S2/S启动子。反之，过表达SART1则明显抑制了HBV核心启动子活性，但对HBV pre-S1或pre-S2/S和X启动子无影响。同样的，JAK抑制剂处理后，SART1敲低仍可增强HBV核心启动子或X启动子的活性。
这些数据表明，SART1能够以IFN通路独立的方式抑制HBV启动子活性。
图6. SART1对不同HBV启动子的作用
为了探讨SART1与cccDNA的相互作用是否具有调节作用，作者用HBV感染稳定过表达SART1的HepG2-NTCP细胞，并进行cccDNA ChIP实验。如下图7显示，只有组蛋白H3与cccDNA相关，而SART1与cccDNA无关。
图7. SART1与cccDNA相关性分析
随后，作者验证了SART1对调控HBV启动子激活的转录因子的作用。结果显示，敲除/过表达SART1显著改变了HNF4α mRNA水平，同时这种改变降低了HNF4α与cccDNA的相关性（见图8）。为了证实这一作用，作者使用AAV介导对HNF4α结合位点进行突变，与预期的一样，突变组的HBV总复制水平为比野生型低。因此，作者得出结论：SART1可以独立于IFN通路特异性抑制HNF4α的表达，以此抑制HBV核心启动子的活性。
图8. SART1对HBV转录因子HNF4α表达的调节作用
下一步，作者进行体内回复实验。AAV介导的验证实验显示，小鼠模型上能够重复体外实验结果，即SART1敲低/过表达能够影响HNF4α的表达和HBV的复制。
最后，作者探讨了SART1如何限制HNF4α转录的机制。qRT-PCR结果显示，SART1的下调显著增加了HNF4α及其选择性剪切典型异构体α1、α2、α7、α8的mRNA水平。然而，HNF4α亚型之间没有差异，这说明SART1不能影响HNF4α mRNA的剪接。
另一种假说中，HNF4α转录调控通过与其启动子的直接相互作用完成。因此，作者研究了SART1对成人肝脏中调控HNF4α转录的P1启动子的影响。结果显示，下调SART1显著提高了HNF4α P1启动子的活性。其后ChIP检测证实，SART1被招募到HNF4α近端P1 启动子区域（-500-0）。然后通过超声切割染色质至约100 bp/20 bp，对P1启动子不同区域进行ChIP PCR。如下图9显示，SART1与HNF4α P1启动子在∆309-288处相关联。综上所述，SART1通过与HNF4α近端P1启动子(-309到-288)区域相关联来限制HNF4α的表达。
图9. SART1对HNF4α启动子的影响
总之，以上数据表明SART1通过抑制HNF4α来限制HBV cccDNA 的转录。需要进一步的研究来确定是否SART1可用于抑制慢性乙型肝炎患者中的HBV，并评估SART1在抗HBV治疗中的潜在作用。更详细地了解调节这一过程的机制，不仅将推进我们对HBV基本病毒学的知识，而且还有助于发现新的抗病毒靶点，推动未来发展实现HBV治愈的方法。
