新品 | 荧光探针OxLight1，高灵敏度检测食欲素神经肽释放

2月10日，瑞士苏黎世联邦理工学院的Tommaso Patriarchi团队在Nature Methods上发表《A genetically encoded sensor for in vivo imaging of orexin neuropeptides》。首次披露荧光探针OxLight1，并展示其在体直接检测食欲素神经肽的高敏感度和高时空分辨率。

图1 | https://doi.org/10.1038/s41592-021-01390-2

食欲素又称下丘脑分泌素（hypocretin），在1998年被美国科学家SakuRi于下丘脑发现。进一步研究发现，食欲素不仅在下丘脑发挥作用，产生食欲素的LHA和PeF神经细胞轴突投射延伸至整个中枢神经系统，包括脑干、腹侧被盖区、前额叶皮质、蓝斑核和丘脑，通过复杂的神经通路发挥作用。

自被发现以来，食欲素与睡眠-觉醒调控、能力代谢、内分泌系统的密切关系引起了广泛的关注。正在进行的研究还揭示，促食欲素信号在调节唤醒和情绪状态（包括人类恐慌发作）以及冒险、奖励感知和决策方面有着显著作用。

为了直接在体检测食欲素神经肽的释放，作者团队基于多巴胺探针dLight1改造，将循环排列的绿色荧光蛋白工程改造为人类2型食欲素受体（ox2r），确定一种基因编码的食欲素荧光探针 OxLight1。

图2 | OxLight1特征

在HEK293T细胞中，对其天然内源性配体orexin-A，ΔF/F0 = 906 ± 28% ; 对orexin-B，ΔF/F0 = 859 ± 27%。对其天然内源性配体orexin-A表观亲和力EC50=75 ± 6nm（in HEK cell），EC50=127 ± 13nm（in neurons）；orexin-B表观亲和力EC50= 47 ± 5nm（in HEK cell），EC50=110 ± 10nm（in neurons）。这说明，OxLight1在预期的生理范围内对食欲素神经肽均具有高灵敏度。

同时，OxLight1只响应OXA的变化，具有高度分子特异性（见下图3）。另外，OxLight1对内源性信号转导通路的干扰也微乎其微。

图3 | OxLight1对高浓度（10μM）不同神经肽的响应

Oxlight1的性质在脑片和活体中进一步表征。

在小鼠LHA中注射AAV-OxLight1，2-3周后切片可观察到绿色荧光。同时，增加 orexin-A 浓度，使Oxlight1荧光强度呈剂量依赖性增加。

作者利用光遗传和光学记录，以监测神经元活动与食欲素释放之间的关系。AAV9-hOX-ChrimsonR注射于目标区域，在光刺激下观察到明显的Oxlight1信号上升和衰减（见下图4）。因此，Oxlight1可高灵敏度且快速检测活体动物的刺激诱发的食欲素释放。

图4 | OxLight1荧光对光遗传刺激频率变化的反应

紧接着，作者在模型清醒状态下，评估了OxLight1的灵敏度和是否能够记录食欲素瞬变。在跑步行为和急性压力（拾尾）下，小鼠体内OxLight1的光学记录均显示食欲素明显增加。而突变探针OxLight-ctr在相同条件下则没有显示瞬态响应。这些结果表明，OxLight1准确地报告了自然行为引起的食欲素的内源性释放。

图5 | 监测与自然行为相关的促食欲素动态

接着，作者追踪了睡眠-觉醒周期中的食欲素动力学。在多导睡眠图记录中，通过AAV-OxLight1注射，在两个不同的大脑深部区域进行了OxLight1的光学记录。

作者发现，睡眠和觉醒不同阶段，包括清醒、非快速眼动NREM、快速眼动REM，OxLight1信号波动较大。其中在REM睡眠开始后食欲素水平迅速下降并保持低水平，清醒和NREM睡眠时食欲素水平平均高于REM睡眠期，REM睡眠到苏醒的过渡期食欲素水平才迅速增加。

这说明食欲素的快速释放与睡眠到觉醒的转变有关，也说明OxLight1可用于监测睡眠-觉醒周期中食欲素的瞬变。

图6 | 睡眠-觉醒周期中的食欲素动力学

此外，OxLight1双光子成像还揭示了麻醉苏醒期间小鼠体感皮层2/3层的食欲素释放。因此，OxLight1和高分辨率双光子显微镜的结合，开启了前所未有的在活体动物中，高时空分辨率直接绘制食欲素信号的可能性。

图7 | 麻醉苏醒过程中皮质促食欲素动力学的双光子成像

总的来说，这篇文章不仅首发了食欲素高灵敏度、高时空分辨率检测荧光探针OxLight1，还剖析了神经元活动和神经肽释放之间的关系。

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