简介
狂犬病毒（Rabies Virus，RV）属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）狂犬病毒属（Lyssavirus），其基因组是长约12 kb的单股负链RNA，由3′端至5′端依次排列着N、P、M、G和L共5个狂犬病毒的结构基因，分别编码核蛋白、磷蛋白、基质蛋白、糖蛋白和转录酶大蛋白（如图1 ）。
图1. RV粒子示意图（图片来自whelanlab网站）
RV在宿主体内，病毒糖蛋白G介导病毒粒子与细胞表面受体结合，通过内吞作用进入细胞。随后通过pH介导膜融合，促使RV基因组释放到细胞质中。感染病毒粒子内包装的L、N、P共同构成的聚合酶复合物以基因组负链RNA为模板启动转录表达，复制，组装，出芽产生子代病毒。（如图2）
图2. 狂犬病毒生命周期示意图（图片来自维基百科）
野生型RV是人畜共患的狂犬病的致病因子，在神经系统中具有传播属性，对人和动物均具有较高致病性。因此本公司RV产品以狂犬病毒疫苗株（SAD B19或CVS-N2c）且缺失G蛋白的复制缺陷型RV (RV-SAD-ΔG/ RV-CVS-ΔG) 为骨架改造而来。随着反向遗传学手段的成熟，经过改造的RV，可用于神经回路研究。RV感染中枢系统后，主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞；被感染的神经元在一定时间内（7-12天）几乎不发生明显病变及裂解。目前RV系统可分为逆向标记系统和逆向跨单突触系统。
第一代逆向标记系统（RV-SAD-B19G-ΔG）
RV的囊膜糖蛋白（glycoprotein，G）是其逆行跨突触所必需的蛋白，G蛋白缺失的RV（RV-SAD-ΔG）会丧失跨突触能力，但其复制及转录不受影响（可持续高丰度表达外源基因），因此，包裹SAD B19G蛋白的RV（RV-SAD-B19G-ΔG）携带报告基因后，可逆向高亮度标记神经元精细形态。
第二代逆向标记系统（RV-CVS-N2C(G)-ΔG）
第二代逆向标记系统采用CVS-N2c毒株，它具有更低的神经毒性以及更强的跨突触突触传递能力，第二代逆向标记RV-CVS-N2C(G)-ΔG产品能在相同滴度达到比第一代RV-SAD-B19G-ΔG更好的逆向标记效果，且神经毒性更低。
图3. RV-CVS-N2c-ΔG-EGFP（布林凯斯测试）
第一代逆向跨单突触系统（RV-SAD-EnvA-ΔG）
利用重组的禽类肉瘤病毒（Aviansarcoma-leukosisvirus，ASLV）的外膜蛋白（EnvA）融合蛋白包装RV-SAD-ΔG基因组形成的病毒粒子(RV-SAD-EnvA-ΔG)，可特异性识别EnvA的受体TVA（TVA只存在于禽类细胞中，在哺乳动物神经元中无表达）介导病毒特异性地感染细胞。利用Cre转基因鼠结合Cre-LoxP控制表达TVA及G蛋白的AAV辅助病毒(DIO-TVA和DIO-RVG)，可实现只在特定区域特异类型神经元中表达TVA及G蛋白，从而利用RV-SAD-EnvA-ΔG实现对特异类型神经元的逆向跨单级突触标记（如图3）。在此基础上，使RV-SAD-EnvA-ΔG带上ChR2及GCaMP等基因，可实现对特异类型神经元的直接输出 网络进行功能操纵及活动监测。
图4. RV-SAD-EnvA-ΔG实现神经元的逆向跨单级突触标记（Callaway, et al., The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience, 2015）
第二代逆向跨单突触系统（RV-CVS-EnvA-ΔG）
第二代逆向跨单突触系统采用CVS-N2c毒株，利用Cre转基因鼠结合Cre-LoxP控制表达TVA及G蛋白的AAV辅助病毒(DIO-TVA 和DIO-N2cG)，可实现只在特定区域特异类型神经元中表达TVA及G蛋白，从而利用RV-EnvA-ΔG实现对特异类型神经元的逆向跨单级突触标记(原理同第一代逆向跨单突触系统)。RV-CVS-EnvA-ΔG与第一代逆向跨单突触系统比较，它具有更低的神经毒性以及更强的跨突触突触传递能力。
图5. RV-CVS-EnvA-ΔG-EGFP（布林凯斯测试）
应用
1）特定区域特异类型神经元的全脑单级输入网络标记；（见案例展示二）
2）两个区域特异类型神经元跨单级输入网络标记；（见案例展示一）
3）三级连接网络的跨单突触标记。
4）携带ChR2或GCaMP的RV应用
产品列表
布林凯斯RV系列产品分为RV-CVS株和SAD-B19疫苗株。
RV-CVS株产品列表：
SAD-B19株产品列表：
案例展示
实例一：逆向标记海马锥体神经元中同时作用于mPFC和ACB中的GABA能神经元（图6，PMID: 31285615）
实验动物：抑制性神经元(SST, PV, VIP)的Cre小鼠
使用的病毒：RV-EnvA-GFP，AAV-DIO-TVA-hBFP和AAV-DIO-RG
实验方法和结果：在抑制性神经元(SST, PV, VIP)的Cre小鼠mPFC脑区注射RV-EnvA-GFP以及Cre依赖的辅助病毒AAV-DIO-TVA-hBFP和AAV-DIO-RG实现逆向跨单级突触，同时在ACB脑区注射从轴突末梢吸收的RV-DG-DsRed，病毒逆向标记海马体投射到ACB区的神经元，最终找到海马体中同时调控mPFC和ACB区的GABA能神经元。（如图6）
图6. 标记海马锥体神经元中同时作用于mPFC和ACB中的GABA能神经元
实例二：VTA多巴胺能神经元分离的支配NAC和mOT（图7，PMID: 29251597）
实验动物：C57BL/6 mice
使用的病毒：RV-DG-DsRed和RV-DG-GFP，滴度10的8次方TU
实验方法和结果：分别注入100 nl RV-DG-DsRed和RV-DG-GFP在NAC和mOT中，1周后灌流取材，可在VTA追踪到神经元。（如图7）
图7. VTA多巴胺能神经元分离的支配NAC和mOT
