新品 | 光敏蛋白还能如此全能？ChRmine全系列各有所长

近期，东京大学加藤英明（Hideaki E. Kato）课题组联合斯坦福大学霍华德休斯医学研究所卡尔·迪赛罗斯（Karl Deisseroth）课题组，在Cell上发布的文章《Structural basis for channel conduction in the pump-like channelrhodopsin ChRmine》（点击文末阅读原文显示），揭示了ChRmine的三维结构，并且成功地开发出三种ChRmine变体。

图1 | 10.1016/j.cell.2022.01.007

ChRmine是一种最近发现的通道型视紫红质，表现出不同凡响的性能，为光遗传学创造了新的机会。ChRmine虽然具有通道视紫红质功能，但其氨基酸序列具有类似于Pump型的特征，因此其结构特点和通道机制仍然神秘。鉴于此，作者利用冷冻电镜以超高的2.0 Å分辨率确定了ChRmine非典型结构：ChRmine呈三聚体的Pump型。

图2 | ChRmine单体

ChRmine结构具有以下特征：①在低聚化数、整体单体结构（见图2）和质子受体方面与HsBR泵惊人地相似；②第二个横跨膜（transmembrane，TM）螺旋在细胞内外向外塌陷/倾斜；③TM3螺旋在膜中间展开，其空腔（席夫碱和D115之间）被三个水分子占据（见图3）；④第一个细胞外环（Extracellular Loops，ECL1）长且扭曲。

图3 | ChRmine（红色）和HsBR（蓝色）的席夫碱区域

鉴于ChRmine独有的结构，其具有一些其他光敏蛋白不具备的优势。如ChRmine可提供更大的光电流，也可在低频刺激下产生波峰，故其可用于需要更低发热或更深脑区的操控。Karl Deisseroth既往研究[2]中也提及，ChRmine可实现特定神经环路的经颅光激活，包括中脑和脑干结构，深度达到惊人的7mm，其精确度也达到了毫秒级，并且这种行为调节无需要手术干预。同时，深层经颅光遗传学操控的脑区未受组织发热或其他光毒性作用的损伤。

随后，作者应用这一结构特征，通过定点突变对ChRmine进行了改造。力求利用ChRmine能被长波长光刺激这一特征，创造一系列改进ChRmine特性的光遗传学新工具。

作者尝试的突变包括席夫碱、离子通道静电点位相关位点[3]等，以弥补其缺点。结果发现，静电点位相关位点H33R、D92N和E154Q这三个突变效果最为明显。尤其是H33R突变，其速度较WT提高了两倍之多（见图4）。作者将这种快速动力学变体命名为hsChRmine（for high speed）。

图4 | 六种变体的开启和关闭动力学

使用与之类似的方法，作者修改了ChRmine的光谱特性，使之红移以提高与蓝光激活的遗传编码钙离子指示剂（GECIs）的兼容性。结果显示，视黄醇结合袋（retinal binding pocket，RBP）双突变体I146M/G174S可显著增强红移。作者将这种红移变体命名为rsChRmine（for red-shifted）。

图5 | RBP变体的光电流比汇总

随后，作者进行了一系列的验证发现，这两种变体（hsChRmine和rsChRmine）均能够在神经元中强表达。就算是与较新的ChroME2f和ChroME2s比较，也具有明显优势。

图6 | 不同光敏蛋白共聚焦成像

尽管既往研究中快速动力学和红移策略会降低光敏蛋白的光电流[4-7]，但hsChRmine和rsChRmine都表现出与WT相似的峰值光电流振幅和速度。除此之外，hsChRmine还能实现高达40 Hz的高保真峰值。

图7 | ChRmine变体的特征

在此基础上，作者结合H33R/I146M/G174S这三个突变，构建了同时增进红移和光敏感性的新光敏感通道蛋白，命名为frChRmine（combining faster and further red shifted performance）。尽管frChRmine的光电流有所降低（见图7B），但其动力学和红移均得到了进一步的优化（见图7E&F）。

最后，作者验证了rsChRmine的光学串扰。结果显示，rsChRmine独特的光谱特性提供了最小化的光学串扰。在与GECIs共同体内成像和控制时，rsChRmine也表现出较其他光敏蛋白（WT ChRmine、ChrimsonR等）更强的性能。

图8 | GCaMP6m在表达光敏蛋白的自由移动小鼠中响应594 nm刺激的记录

更值得注意的是，表达rsChRmine的神经元对720和750nm光刺激仍有反应，尽管其功率高于红光。这可能是第一个即使在近红外光（> 740 nm）下也能被激活的视紫红质，也证明了 rsChRmine的出色性能。

图9 | 不同光敏蛋白对近红外光的响应

本研究首次阐明了Pump型的新型通道视紫红质ChRmine的三维结构。这些结果不仅有助于了解各种通道视紫红质的离子渗透机制，而且拓宽了通道视紫红质的结构分析方法范围，为阐明视紫红质的分子机理提供了新的线索。

此外，作者根据其结构信息，创建了rsChRmine（红移）、hsChRmine（快速动力学）、frChRmine（综合增强）这三种变体，进一步发挥了ChRmine出色的性能，特别是rsChRmine的新应用。

这些ChRmine变体不仅丰富了神经科学研究方法，还可用于疾病的基因治疗研究。

ChRmine全系列已上线：

Reference：

[1]     10.1016/j.cell.2022.01.007

[2]     10.1038/s41587-020-0679-9

[3]     10.1038/nature15389

[4]     10.1038/s41586-018-0504-5

[5]     10.1038/s41467-018-04146-3

[6]     10.1038/s41467-018-06421-9

[7]     10.1038/nn.2495

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