新型 |荧光探针G-Flamp1,点亮第二信使cAMP的时空动态变化

时间：2022-08-12 09:24

腺苷-3',5'-环化一磷酸（cAMP）是细胞内关键第二信使，可整合来自多种G蛋白偶联受体（GPCR）的信号，在学习与记忆、药物成瘾和运动控制等生理过程中发挥重要作用。大量研究表明cAMP异常代谢与多种神经疾病和精神类疾病密切相关，如帕金森氏症、阿尔兹海默症、抑郁症和成瘾等等，然而在生物体生理和病理条件下，cAMP信号的特点及调控机理仍有很多细节尚不清楚。


中国科学院深圳先进技术研究所储军老师课题组利用蛋白突变筛选技术，开发了具有高亮度、高灵敏度、合适亲和力和快响应速度等特征的基于环化重排绿色荧光蛋白(cpGFP)的cAMP探针G-Flamp1。相关工作发表于预印本平台《A high-performance genetically encoded fluorescent indicator for in vivo cAMP imaging》一文中。

G-Flamp1探针的开发

在探针构建工作中，作者将cpGFP插入细菌MlotiK1通道的cAMP结合结构域（mlCNBD）中。经过插入位点优化、连接肽优化、荧光蛋白及感应模块优化，得到了高性能的基因编码cAMP绿色荧光探针G-Flamp1。

图1  G-Flamp探针设计原理图及五步定向进化过程



G-Flamp1探针体外特性及晶体结构

在体外实验中，结合/未结合cAMP的G-Flamp1具有不同发色团环境。G-Flamp1在450nm(单光子)或者900-920nm(双光子)激发下，动态范围达最大，即ΔF/F0约为13。G-Flamp1与cAMP亲和力适中，其解离常数Kd值为2.17µM。G-Flamp1可在亚秒时间分辨率上检测cAMP动态变化。


结合cAMP的G-Flamp1探针晶体结构中，mlCNBD和cpGFP的两个连接肽（Trp75/Gly76、Arg318/Val319）分别为高扭曲的β折叠和无规则结构，并且连接肽1与发色团靠近。分子动力学模拟及突变分析均证明连接肽1是影响荧光变化的关键位点。

图2  G-Flamp1的体外特性及晶体结构



G-Flamp1探针在培养哺乳动物细胞中的性能表征

随后，作者进一步在细胞水平上测试G-Flamp1探针。该探针均匀分布在细胞质和细胞核中，本底荧光亮度介于同类探针cAMPr和Flamindo2之间。同时作者验证了G-Flamp1探针在细胞中的动态范围、特异性和可逆性等方面均有优异的表现。

图3  G-Flamp1在哺乳动物细胞中的特性



G-Flamp1探针在果蝇中的应用

cAMP在学习与记忆中至关重要。果蝇脑部蕈形体（MB）Kenyon细胞（MBKCs）中，cAMP信号对获得厌恶记忆是不可或缺的。作者利用Kenyon细胞表达G-Flamp1的转基因果蝇进行cAMP信号的特性研究。双光子成像发现，果蝇受到气味或电击刺激时，MB不同子区域的cAMP信号展示了不一样的时空动态。这暗示不同子区域cAMP可能在联想性学习中起着相对独立的作用。

图4 果蝇受生理刺激时，通过双光子成像检测MBKCs中cAMP动态信号



G-Flamp1探针在小鼠中的应用

为验证G-Flamp1探针在活体动物中检测cAMP动态变化的实用性，作者利用腺相关病毒在小鼠运动皮层中共表达探针G-Flamp1(或G-Flamp1-mut)和红色jRGECO1a钙探针。活体双光子成像检测发现跑步运动诱导小鼠皮层不同神经元产生了不一致的cAMP信号变化，并与钙信号无明显相关性。这反映了小鼠运动时大脑皮层M1神经元反应的异质性。

图5 小鼠在强制奔跑时运动皮层神经元cAMP信号


另一方面作者在小鼠脑深部区伏隔核(NAc)中表达探针G-Flamp1，利用光纤记录听觉巴甫洛夫条件反射任务中小鼠NAc脑区cAMP荧光信号的变化。结果表明随着训练的熟练，小鼠得到奖赏时cAMP信号幅度在降低，而听到相应声频信号时cAMP信号幅度在升高；该特性与多巴胺信号类似，暗示多巴胺释放引起了cAMP信号。

图6  小鼠在听觉巴甫洛夫条件反射任务期间NAc区cAMP信号


综上，G-Flamp1探针具有高信噪比和高时间分辨率，可以报告小鼠活体细胞中cAMP的动态变化。



总 结

在这项研究中，作者构建了一种高性能的基因编码的cAMP绿色荧光探针G-Flamp1，实现了多种模式生物中cAMP信号的动态检测。G-Flamp1可用于高通量筛选靶向cAMP信号通路的化合物。另外G-Flamp1可与其他光谱兼容的探针联用，用于细胞信号转导网络的研究。



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