时间：2022-05-24 08:40
荧光蛋白（Fluorescent protein，FP）是由约220-240个氨基酸组成的蛋白质，在一定波长激发光激活后，可发出不同颜色的发射光。
目前按照发射波长，将荧光蛋白分为几大类，包括RFPs（红色）、OFPs（橙色）、YFPs（黄色）、GFPs（绿色）、CFPs（青色）、BFPs（蓝色）。
✦ 02 荧光蛋白的应用
荧光蛋白主要作为标签对照蛋白，广泛应用于神经科学研究：
● 神经标记及示踪技术
● 目的基因的表达分析
● 启动子活性分析
● 亚细胞定位
... ...
✦ 03 荧光蛋白选择要点
激发波与发射波
实验室成像系统能否满足选择的荧光蛋白激发和发射所需的波长通道。
实验中常需要同时选择两种或以上荧光蛋白进行多色成像时，建议两种FPs的激发和峰值发射波长均相隔50-60nm，避免光串扰。常用多色FPs组合包括：
双荧光（绿-红）
EGFP+mCherry/tdTomato/mRuby
三荧光（蓝绿红/青黄红）
TagBFP/EBFP+EGFP+mCherry/tdTomato/mRuby
聚合性
FP融合表达时，多聚体FP可能会影响融合蛋白的生物学功能或定位，应尽量选择单体FP。
亮度
不同FP光学特性决定其亮度不一，选择足够亮FP以便检测和成像。
光稳定性
长时间激发FP会产生光漂白现象，导致其丧失发光能力，应选择光稳定性较好的FP。
环境敏感性
一些FP的荧光强弱受环境因素，pH、分子氧、温度等影响，如选择pH敏感荧光蛋白时，需考虑其PK值。
✦ 04 常见问题解答
为什么表达的荧光蛋白亮度较低？
● 荧光蛋白
选择荧光蛋白时，需要考虑荧光蛋白自身的荧光亮度和光稳定性，通常建议选择足够亮、光稳定的荧光蛋白以满足实验要求。如EBFP的亮度仅为TagBFP亮度的三分之一，mApple光稳定性要远弱于mCherry。
● 启动子
不同启动子诱导荧光蛋白表达的强弱不同，如UBC启动子只能诱导荧光蛋白的弱表达，可按实验要求选择广谱性或者组织特异性的强启动子，如EF1α、CAG。另外注意有些启动子，如广谱性强启动子CMV在体外细胞中能很好地诱导表达，但在体内实验时则会沉默。
● 表达方式
荧光蛋白与目的蛋白的表达方式包括融合表达和非融合表达。融合表达多用于目的蛋白亚细胞定位、蛋白互作探究，但融合蛋白表达的荧光亮度通常低于单独的荧光蛋白，融合表达时，荧光蛋白可能出现错误折叠等现象，导致检测不到荧光信号或荧光较弱，常选择将FP位于目的蛋白的N端或C端。
● 连接元件
非融合表达主要用于检测目的基因表达水平，一般选择连接肽Linker，如2A肽或IRES将ORF分隔开。选择IRES，下游ORF的表达明显弱于上游ORF（约为上游的10%-20%），体内实验尤为明显。选择2A肽，应考虑其切割效率受上下游ORF序列的影响，常选择P2A和T2A，P2A切割效率最高（某些情况高达100％）。
荧光蛋白增亮小Tips
● 免疫组化
可选择使用荧光蛋白的抗体，通过免疫组化方法放大荧光蛋白信号，以可视化体外细胞培养或体内的荧光蛋白。
● 更换缓冲液
目前常用的多数荧光蛋白的亮度与其所处溶液的 PH 值有明显的相关性，因此合适的 PH 值有助于增强荧光蛋白的发光效率；对于非pH敏感性荧光蛋白，可选择0.05mol/L碳酸钠溶液替代PBS溶液处理荧光标记的脑片，一般情况下， EYFP 和 EGFP 的荧光强度变化较为明显，RFP 的变化较小，部分红色荧光蛋白的变化也相对比较明显。
✦ 05 荧光蛋白特征总介
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