时间：2020-09-14 09:04
多巴胺（DA）是一种遍布大脑的神经递质，在调节情绪和控制运动方面扮演重要角色。监测行为动物DA水平变化，能够帮助研究者更好了解特定信号与行为之间的关系。现阶段常使用基于绿色荧光蛋白（GFP）的基因编辑的DA传感器进行动态高分辨率成像。然而，由于光谱重叠，这些基于GFP的变体无法轻易与常用的光学传感器、执行器相结合使用。
为了弥补这些不利因素，Tommaso Patriarchi及其团队设计了基于mApple的DA传感器的“红移（red2shift）”突变体，命名为RdLight1。这种突变体可以与基于GFP的传感器结合使用，且干扰最小，显示出很高的光稳定性，并可以长时间连续成像。
作者使用cpmApple及其从jRGECO1a派生的连接序列替代原有dLight1.3b中的GFP，形成突变体。在此基础上，为了提高DA敏感性，作者又生成了一个连接子集，位于cpmApple的两侧。经过筛选后，对残基F129进行突变，最终获得膜表达和荧光响应良好的RdLight1。
图1. RdLight1结构及特征
RdLight1的敏感性
原位滴定（神经递质）结果显示，在离体培养的海马神经元和HEK293细胞中，RdLight1对DA的敏感性分别比对去甲肾上腺素（NE）高350倍和60倍。除了高浓度（≥10μM）的肾上腺素外，RdLight1对所有其他测试的神经递质（包括乙酰胆碱，谷氨酸，5-羟色胺，组胺）的反应微不足道。另外，RdLight1也不干扰内源性G蛋白或β-arrestin介导的信号通路。
图2. RdLight1对各种神经递质的响应
双色成像
因为RdLight1是分别基于D1的传感器，因此可与基于DRD2或NE等其他神经递质的传感器结合，进行双色成像，以监测亚型选择性药物反应。如作者实验中，在神经元和星形胶质细胞共培养系统中，选择性使用RdLight1（AAV9-hSynapsin1-RdLight1）和nLight1.3（AAV1-GFAP- nLight1.3）感染，观察到了对DA、NE的特异性反应，和受体特异性拮抗剂的逆转反应。
在小鼠模型的实验中，也观察到了相同的结果，说明RdLight1对内源性DA释放也具有较强的敏感性。
图3. RdLight1和nLight1.3双色成像
多重成像
除去分别给药，RdLight1似乎也提供了在同一位置同时监视多个递质的潜力。作者将RdLight1与谷氨酸传感器iGluSnFR16（AAV5-hSynapsin1-iGluSnFR）共注入纹状体，诱发的DA和谷氨酸瞬变双成像。对单脉冲电刺激的响应，双光子帧扫描结果显示，其具有明显的峰值振幅和衰减动力学。这种多重成像也能同时显示局部DA瞬变和神经元活动。
因此，将RdLight1与其他基于GFP的传感器结合，可以实现神经递质和细胞类型特异性神经活动的多重成像。
图4. RdLight1与谷氨酸传感器（左图）、钙指示剂（右图）的双重成像
多重测量
作者建立光刺激自由行为大鼠模型和糖丸奖赏干预，利用RdLight1和axonGCaMP6f检测信号变化。结果显示，奖赏传递引起上述指标信号的快速增加，两者时间进程相似。这说明突触前钙和多巴胺释放之间的全时程交叉相关很强，没有明显的滞后。因此，RdLight1在DA释放的突触前、后的测量具有高保真性。
多巴胺和谷氨酸释放的多重体内测定也显示相同结果，这说明，RdLight1也具有在同一根光纤下，研究多种相互作用神经递质的能力。
图5. 双色光纤信号记录
综上所述，RdLight1是一种红色的基因编码膜集成强传感器，在活体内具有良好的响应性，强大的光稳定性和信噪比，可配合其他传感器完成多重监测。
参考文献
1、Patriarchi T, Mohebi A, Sun JQ, et al. An expanded palette of dopamine sensors for multiplex imaging in vivo[J]. Nature methods, 2020.
2、Patriarchi T , Cho J R , Merten K , et al. Ultrafast neuronal imaging of dopamine dynamics with designed genetically encoded sensors[J]. Science, 2018.
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