小布tips | 总结盘点超大基因组的AAV载体设计

最近大家肯定常被工具病毒介导的基因治疗刷屏。

有研究者认为，病毒是天生的载体。相较于容易污染的细胞、转导效率低的非病毒载体，工具病毒有着出彩的效果。据 2017 年的统计，迄今为止大约三分之二的基因治疗试验使用病毒载体。

（图源：doi.org/10.1002/jgm.3015）

腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗已经成为某些遗传性疾病的首选治疗方法。2012年欧盟第一次批准基于AAV的药物Glybera治疗蛋白脂肪酶缺乏症，2018年美国第一次批准AAV药物用于治疗先天性失明（遗传性视网膜营养不良）。

尽管，AAV病毒载体可能是最有效的基因治疗载体，但AAV有限的荷载能力使其应用受到了大大的限制。AAV病毒载体装载的DNA序列长度不超过5kb，而且这还要包括一些调控元件，因此AAV病毒载体对于一些较大的基因就无能为力了，这也限制了基因疗法在递送大基因上的应用。

为了克服这种限制，已探索了多种策略。

其一是将大的转基因分割开来，通过2个或3个AAV运输到靶标。其二是促进单个AAV载体传递超大基因。

下面我们将以这两种策略为基础，讨论AAV运输超大基因的可能性。

我们可以将超大的基因表达框分开，分成两个或三个部分，再由两个或三个单独的AAV载体携带。同时向靶细胞传递后，在细胞内重组整个大基因表达框，表达完整的大蛋白。

根据重组机制的不同，可将拆分表达框的方法分为：反式剪接、重叠、杂交和三重AAV载体。

Trans-splicing AAV Vectors

反式剪接AAV载体利用了AAV固有的聚合，通过ITR介导的分子间重组，如下图所示。到目前为止，这种方法已成功地用于血管性血友病von Willebrand因子、Stargardt疾病ATP结合框4、1B型Usher综合征肌球蛋白VIA及血友病A的作用因子VIII的传递。
 

Overlapping AAV Vectors

重叠AAV载体利用编码序列中的同源重组来重建一个大的基因表达框。其中一个AAV载体包含启动子和编码序列的5’部分，而另一个AAV载体携带编码序列和polyA信号的3’部分。这两个AAV载体中的编码序列共享一个同源区域，并依次诱导靶细胞中大蛋白的表达。

同时，重叠AAV载体的效率在很大程度上依赖于编码序列重叠区域的同源重组。

Hybird AAV Vectors

杂交AAV载体结合了反式剪接和重叠AAV载体的机制。与反式剪接载体相比，杂交载体中重叠区域的同源重组效率更高，大大增加了成对载体的方向正确性。这种方案已成功地用于传递大的治疗基因，包括CFTR、ABCA4 and MYO7A和Dysferlin等。

Triple AAV Vectors

双病毒策略可将AAV包装容量扩充到10kb，但对于一些巨大的基因转移仍是不够的，基于三病毒的策略应运而生。这些载体被设计成转移多达15kb的遗传物质。例如，利用混合ITRs和反式剪接的三重AAV载体成功地诱导了营养不良肌肉中全长11kb的营养不良蛋白基因的表达；利用反式剪接和杂交三重AAV载体，全长的CDH23和ALMS1成功在视网膜中表达。

但是目前这种方案的转导效率较低。

总的来说，以上策略均有较大的发展潜力。但值得注意的是，双重或三重载体共同传递，不可避免地增加了使用载体的剂量。高剂量AAV给药不可避免地产生严重的毒性，因此“在低剂量下载体高效率转导”至关重要。

单个AAV载体传递大型表达框的策略应运而生。

Fragmented Oversized AAV Gene Delivery

在包装超大基因组时，达到最大包装容量或遇到终止信号时包装即会停止，从而产生不同大小的异质片段基因组。当含这些片段的AAV载体传递到靶细胞时，片段基因组的同源重组恢复表达框并介导大蛋白的表达。

大体上，这种片段化基因传递方式效率低于完整基因传递。然而，在某些情况下，单个AAV片段基因传递比多重AAV载体更有效。例如，在肌肉和视网膜中，片段AAV载体比反式剪切AAV载体诱导更强的荧光素酶表达（PMID: 23939025）。在传递另一个大基因MYO7A时，重叠AAV载体的表达明显低于单个AAV片段基因传递（PMID: 23344065）。

因此，单个AAV片段基因传递一种可行的替代方案。

Other strategies

还有几种额外的策略帮助单个AAV载体传递超大基因组，包括衣壳改造、改善病毒产生、给药蛋白酶体抑制剂、优化转录元件等。

比如，VP2衣壳蛋白的缺失可以将AAV载体的包装能力提高到6kb（PMID: 16014954），采用HBoV1衣壳蛋白的AAV成功地包装了CFTR基因组（PMID: 23896725），在过大的AAV. VIII传递时给予蛋白酶体抑制剂可将Factor VIII的表达增强三到六倍（PMID: 20700109）。

除了单个超大基因组的传递，多个基因组的传递问题也值得探讨。

这其中可以选择多种策略，如将多个片段塞入同一个AAV载体，或同时传递两个甚至三个AAV载体。

Single AAV Vectors

如果两个转基因的大小在5kb的包装限制内，这两个转基因的编码序列可以被设计成一个AAV载体。

Co-delivery of Two or Three AAV Vectors

如果两个转基因均大于5kb，则可以使用两个携带不同完整基因表达框的AAV载体。既往研究证实，两个携带不同报告基因的AAV载体可以调节这两个蛋白在肌肉[PMID: 15353044]、视网膜和海马[PMID: 22545762]的同一细胞中的表达。

同样，使用三个AAV载体分别表达三个基因的情况。在Shen等人[PMID: 10945765]和Muramatsu等人[PMID: 11860702]的研究中，通过三个AAV载体分别表达了TH、AADC和GCH基因，改善了帕金森小鼠模型的疾病表型。

随着临床试验的日益成功，AAV基因治疗将扩展到更多的疾病。多种应用策略的探索也为解决AAV包装容量限制问题提供了方案。一些传递超大基因的策略已经取得了显著成效进展。随着我们不断努力开发和调整AAV载体，毫无疑问AAV基因治疗将有助于治疗更多的疾病。
 

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