时间：2022-03-25 17:38
基因沉默是真核生物细胞基因表达调节的重要手段。RNAi是其中一种有效工具，通过降低特定基因的mRNA表达水平，达到抑制对应蛋白表达的目的。
RNAi技术应用的关键点
必须有适当的方式将外源性的小干扰RNA（siRNA）导入到目标生物体内，经过一系列生化路径，引发RNA干扰效果。
siRNA的来源
1） 体外合成
以人工方式合成所需的siRNA片段，后导入目标细胞。
劣势：瞬时表达，取决于细胞的转染效率、无法实现长期的 RNA干扰效果。
表1 | 几种体外合成siRNA的方法比较
2） 体内合成
将所需要的siRNA前体（shRNA）用载体导入目标细胞中，通过细胞内部机制形成成熟的siRNA，最终与AGO-2等蛋白结合形成转录沉默复合物（RISC），达到抑制基因表达的目的。此方法避免了单纯以人工方式在体外合成siRNA的局限性，能够实现较长时间的稳定表达，且具有较好的干扰效果。
设计shRNA载体
通常选择用病毒/质粒作为将shRNA导入细胞的载体，被导入的载体能在生物体内产生siRNA。
设计的载体DNA应该包含以下几部分：
1） 同义链（sense strand）：与生物体内转录出目标mRNA时所需的基因序列相同；
2） 反义链（antisense strand）：与同义链互补配对，转录此序列则可得到与目标mRNA互补的siRNA；
3） 非互补的序列：使得载体经转录后，能形成loop结构（如：5'-TCAAGAG-3'序列）；
4） shRNA两端限制性切割酶切割位点（如：BamH I & Hind III）。
设计siRNA序列
除了选择恰当的siRNA载体外，设计siRNA序列时需要注意以下几点：
1） 设计使得末端含有5-6个A（T）
siRNA载体是由RNA聚合酶III转录而表达，RNA聚合酶III可转录哺乳动物体内大部分的小片段RNA，其特点是：当转录到5-6个腺嘌呤核苷酸A时会停止转录，故导入的siRNA载体经转录后，可得到末端具有5-6个尿嘧啶的siRNA；
2） 选择2-5个目标基因的不同部分序列
生物体内的目标mRNA，可能部分区域被调节蛋白附着，造成RNAi不易进行，故要选择转录出目标mRNA的不同基因片段，才能使得抑制基因表达的效率提升。
RNAi目标序列的选取原则
1） 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3'端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点；有研究结果显示GC含量在45%-55%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效；
2） 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列；例如实验BLAST比对（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）；
3） 选出合适的目标序列进行合成；通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
阴性对照
一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和目的靶细胞中其他基因没有同源性。
RNA干扰效率检测
一般应该从mRNA水平、蛋白质水平、细胞表型水平三个层次来检测干扰效率。mRNA水平可使用RT-PCR或Real-time PCR法检测，蛋白质水平可使用Western-blot、ELISA或免疫组化法完成检测，细胞表型水平可应用MTT、克隆形成实验、流式细胞检测、细胞小室实验等方法检测。
实例展示
Lewandowski等人用AAV介导表达shRNA抑制成年大鼠的PTEN的表达，导致核糖体蛋白pS6磷酸化增加。
图1 | 成年大鼠皮质内注射AAV抑制PTEN的表达（Lewandowski, et al., Journal of Neuroscience, 2014）
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